背景介紹:一氧化二氮(N2O)是一種重要的臭氧消耗物質(zhì)和強大的溫室氣體,其效力大約是CO 2的265倍。在過(guò)去的三十年中,大氣N2O濃度以每年0.73 ppb的速度逐漸增加。盡管N2O排放主要來(lái)自農業(yè)活動(dòng),但應密切監測污水處理廠(chǎng)的貢獻N2O是在污水處理廠(chǎng)的生物脫氮過(guò)程中產(chǎn)生的,例如來(lái)自氨氧化、硝化器反硝化和不完全異養反硝化。外部添加的作為電子供體的碳源,例如乙醇、甲醇和醋酸鹽,控制著(zhù)在反硝化生物反應器中的反硝化性能和N2O排放量。盡管實(shí)際實(shí)施了異養反硝化細菌的外部碳供應,但尚未系統地研究它們的N2O消耗動(dòng)力學(xué)和不同碳源的性能。因此,有必要進(jìn)一步探索各種碳源對作為反硝化最后一步的N2O消耗的生物動(dòng)力學(xué)的影響。本研究調查了不同有機碳源對經(jīng)典反硝化進(jìn)化枝I和進(jìn)化枝II型N2O還原細菌N2O消耗生物動(dòng)力學(xué)的影響。鑒于有機碳源的可用性是主要決定N2O消耗潛力的因素之一。研究人員假設有機電子供體可能是控制(1)N2O相關(guān)生物動(dòng)力學(xué)和(2)N2O消耗活動(dòng)的彈性的因素之一在不同的N2O還原劑中以不同的方式暴露于氧氣中,這取決于它們包含的能量代謝相關(guān)基因組。為了驗證這些假設,研究人員使用微呼吸系統對N2O進(jìn)行了在線(xiàn)監測,在有氧間隔和無(wú)氧間隔的缺氧條件下培養的微生物培養物中的N2O和溶解氧(DO)濃度。


Unisense微電極系統的應用


建立了用于同時(shí)監測氧氣和N 2 O的微呼吸測量系統,以檢查不同有機碳源對N2O還原菌生物動(dòng)力學(xué)的影響。細胞培養物在可容納兩個(gè)微電極和攪拌棒(Unisense)的H型瓶(有效體積為10 mL)中孵育。每種細菌進(jìn)行五批測試,每批測試都有不同的碳源,即乙酸鹽、琥珀酸鹽、甘油、甲醇或乙醇。在每批試驗開(kāi)始時(shí),將10 mL細胞懸液移入的H形微呼吸小瓶,微呼吸瓶中裝有氧氣和N2O微呼吸電極(Unisense,Aarhus,Denmark),在小瓶中沒(méi)有頂部空間。隨后,將20μL的濃縮N 2 O溶液(25°C下為24 mM)注入小瓶中,以達到大約50μmol L-1的初始N2O濃度。如下添加碳源和電子源:乙酸鹽(320μmol L-1)、甲醇(420μmol L-1)、乙醇(210μmol L-1)、甘油(180μmol L-1)或琥珀酸酯(180μmol L-1)。過(guò)量添加有機化合物以確保N2O還原活性不受電子供體短缺的限制。微呼吸系統在保持在30±0.2°C的水浴中運行,以便與之前在相同溫度下進(jìn)行的結果進(jìn)行比較,并以500 rpm的速度攪拌。使用Sensor Trace Suite軟件(Unisense)處理N2O和氧氣測量值。DO濃度與N 2 O濃度一起監測,因為它是影響N 2 O消耗活動(dòng)的關(guān)鍵因素。


實(shí)驗結果


本研究系統地比較了四種N2O還原菌在5種不同碳源下的N2O消耗和N2O回收情況。當N2O作為唯一的電子受體時(shí),有機碳源顯著(zhù)影響了異養型N2O還原菌的生產(chǎn)性能、生物動(dòng)力學(xué)和生物量產(chǎn)量。在碳源中,乙酸和琥珀酸對DO和N2O的消耗率最高,且進(jìn)化支II型Azospira spI13的消耗率高于進(jìn)化支I型Ps.stuzeri和Pa.denitrificans。由好氧向缺氧過(guò)渡后的N2OR恢復力主要依賴(lài)于N2O還原菌的類(lèi)型和補充的碳源。當添加乙酸和琥珀酸時(shí),II型nosZ菌的生物量比I型nosZ菌高。

圖1、微呼吸系統示意圖,建立了用于同時(shí)監測DO和N 2 O的微呼吸測量系統,以檢查不同有機碳源對N 2 O還原菌生物動(dòng)力學(xué)的影響。

圖2、反硝化細菌(進(jìn)化枝I)、施式假單胞菌(進(jìn)化枝I)、固氮羅菌株I09(進(jìn)化枝II)和固氮羅菌株I13(進(jìn)化枝II)中N 2 O(紅色)和氧氣(藍色)濃度分布的動(dòng)態(tài)變化。使用乙酸鹽(a)、琥珀酸鹽(b)、甘油(c)、乙醇(d)和甲醇(e)作為碳源。體系中N2O注射用黑色垂直箭頭表示。圖中顯示了代表性的N 2 O和DO濃度分布。

圖3、以乙酸、琥珀酸、甘油、乙醇和甲醇為碳源對應的反硝化細菌(clade I)、施式假單胞菌(cladeⅡ)/固氮羅菌屬I(mǎi)09(cladeⅡ)、固氮羅菌屬I(mǎi)13(cladeⅡ)的氧氣消耗率的全細胞Michaelis-Menten曲線(xiàn)。這些數據是從三次試驗中獲得的。

圖4、以乙酸、琥珀酸、甘油、乙醇和甲醇為碳源對應的反硝化細菌(clade I)、施式假單胞菌(cladeⅡ)/固氮羅菌屬I(mǎi)09(cladeⅡ)、固氮羅菌屬I(mǎi)13(cladeⅡ)的氧化亞氮的消耗率的全細胞Michaelis-Menten曲線(xiàn)。這些數據是從三次試驗中獲得的。

圖5、缺氧條件下N2O還原活性的恢復。橫軸表示DO耗盡后的時(shí)間。數據點(diǎn)來(lái)自三次N2O呼吸試驗。實(shí)線(xiàn)表示各碳源N2O還原恢復的線(xiàn)性模型,虛線(xiàn)表示95%置信區間。


結論與展望


利用一氧化二氮(N2O)還原細菌是減少工程系統的N2O足跡的一種很有前景的策略。使用優(yōu)選的有機碳源作為電子供體可加速這些細菌對N2O的消耗。然而當喂食不同的有機碳物種時(shí),它們的N2O消耗潛力和活性仍不清楚。本論文研究人員通過(guò)研究它們的生物動(dòng)力學(xué)特性和基因組潛力,系統地比較了各種有機碳源對N2O還原細菌活性的影響。五種有機碳源——乙酸鹽、琥珀酸鹽、甘油、乙醇和甲醇被送入四個(gè)含有進(jìn)化枝I或進(jìn)化枝II nosZ基因的N2O還原細菌。使用Unisense微呼吸系統對四種N2O還原細菌菌株進(jìn)行了呼吸測定分析,確定了響應于不同喂養方案的溶氧和N2O消耗生物動(dòng)力學(xué)的不同變化。不管N2O還原菌是什么,使用乙酸鹽和琥珀酸鹽都獲得了更高的N2O消耗率和更高的生物質(zhì)產(chǎn)量。通過(guò)基因組分析研究了代謝補充碳源的潛力,其結果證實(shí)了N2O消耗生物動(dòng)力學(xué)結果。此外,電子供體的選擇對N 2O消耗活動(dòng)在氧氣暴露后恢復。本研究的結果有助于為污水處理廠(chǎng)異養反硝化過(guò)程中產(chǎn)生和排放的N 2 O制定有效的緩解策略